Poznámky k patofyziologickému a klinickému kontextu COVID-19 so zameraním na laboratórnu diagnostiku

Gustáv Kováč, Anna Porubenová, Michal Farkaš, Pavel Blažíček, Stanislav Oravec, Štefan Kečkéš, Alena Kristova Ústav chémie, klinickej biochémie a laboratórnej medicíny LF SZU Bratislava Úvod Cieľom poznámok je poskytnutie aktuálnych informácií o ochorení COVID-19 so zameraním na oblasť laboratórnej diagnostiky Sústreďujeme sa na podstatu stručnosť prehľadnosť textu Problematika je aktuálna a vo vývoji, preto informácie nie sú definitívne nemôžu byť vyčerpávajúce Metóda V časti “Výsledky“ sa vyjadrujeme k patofyziologickému kontextu klinickému kontextu a zameriavame sa na možnosti laboratórnej diagnostiky COVID-19. V časti „Diskusia“ sa vyjadrujeme k ďalším aspektom pertraktovanej problematiky Na záver uvádzame súhrn poznatkov odporúčania zoznam použitej literatúry. Výsledky Poznámky k patofyziologickému kontextu COVID-19 = COrona VIrus Disease 19 názov ochorenia dolných dýchacích ciest (MKCH: U07.1) alternatívny názov ochorenia SARS-CoV-2 infection SARS-CoV-2 = Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2 názov vírusu – etiologického agens Vírus SARS-CoV-2 patrí do čeľade koronavírusov, častých pôvodcov nádchy koronavírusy sú obalené, pleomorfné alebo sférické rozmery viriónu: 150 – 160 nm genóm vírusu tvorí ~30 kb a kóduje ~9860 aminokyselín virión obsahuje: (+)ssRNA, Spike (S) glykoproteín, nukleokapsid (N) fosfoproteín, membránový (M) proteín, Small Envelope (E) glykoproteín, Obal (Envelope) Poznámky ku klinickému kontextu Prenos infekcie vírus sa prenáša z človeka na človeka, sekundárne kvapôčkami (vzduchom) alebo kontaminovanými predmetmi riziko je najvyššie počas symptomatickej fázy prenos je možný tiež v pre-symptomatickej fáze, obyčajne 4 – 6 dní pred objavením sa symptómov existujú správy o možnom prenose aj po ústupe príznakov za rizikové (kontaminované) možno pokladať aj všetky biologické materiály od infikovaného pacienta, vírus sa vylučuje stolicou Inkubačná doba 2 – 14 dní Vírus postihuje pľúca (pneumónia) menovite alveolárne epiteliálne bunky (pneumocyty typ 2) na membránach alveolárnych buniek sa vyskytuje receptor s afinitou k vírusu za možný receptor sa pokladá Angiotenzín-konvertáza (ACE2) vírus preniká do bunky za pomoci vírusového S-proteínu koncentrácia receptoru v bunkovej membráne sa s vekom zvyšuje (riziko fatálnej pneumónie) Hlavné príznaky ( symptómy ) vyplývajúce z pneumónie: horúčka, kašeľ, dýchavica, obraz pneumónie na zobrazovacích vyšetreniach Nešpecifické príznaky: myalgia, únava, neobvyklé záchvaty bolestí hlavy Priebeh ochorenia pacientov 80% mierny, 15% ťažký, 5% kritický Riziko progresie k ťažkému priebehu pacienti nad 60 rokov komorbidity (malignita, DM, KVS ochorenia, chronické respiračné ochorenia) Poznámky k možnostiam laboratórnej diagnostiky Možnosti laboratórnej diagnostiky COVID-19 RT-PCR alebo iné amplifikačné metódy detekcia vírusového antigénu detekcia protilátok IgG, IgA, IgM sekvenácia vírusového genómu kultivácia na bunkových kultúrach Typy vzoriek orofaryngeálny ster (32%) nasofaryngeálny ster (63%) spútum vzorky z dolných dýchacích ciest Poznámky k real time reverznej transkriptáze PCR (rRT-PCR) Poznámky ku RNA extrakcii špecifická platforma na extrakciu nukleových kyselín špecifický kit pre RNK extrakciu manuálna extrakcia teplota 98oC, 10 min Poznámky ku génovej amplifikácii Gény na amplifikáciu N gén E and RDRp gény Orf 1 ab and N Senzitivita a špecificita závisí na type primérov kvalite vzorky Príčiny falošnej negativity nízka kvalita vzorky príliš včasný odber vzorky nesprávny transport a skladovanie vzorky technické príčiny ( mutácia vírusu ) + ( PCR inhibícia ) Iné amplifikačné systémy Reverzná transkriptáza „loop mediated isothermal amplification“ ( 30 min ) Integrované systémy STAT-DX ( Qiagen ) Xpert Xpress Sars-Cov-2 ( Cepheid ) Filmarray ( Bio Merieux ) Poznámky k detekcii protilátok ( IgA, IgM, IgG ) Lateral flow / ELISA / Chemiluminiscencia Kinetika imunitná odpoveď začína okolo 5-6 dňa po infekcii IgA - neexistuje veľa prác Stanovenia kolorimetrické versus fluorimetrické vysoká variabilita rozličných kitov Senzitivita nízka počas prvých dní po 10 dňoch sa zvyšuje na hodnotu okolo 70% Jednotky intenzívnej starostlivosti dekongescia Poznámky k detekcii antigénu ( lateral flow ) Stanovenie fotometrické ( coloidal gold ) fluorimetrické Senzitivita menej ako 50% závisí na „viral load“ Poznámky k podpornej laboratórnej diagnostike Zápalové parametre hsCRP IL-6 FW feritín Koagulačné parametre PT APTT D-dimér Rutínne biochemické parametre AST, ALT albumín, prealbumín urea, kreatinín glukóza CK-MB cholínesteráza cystatín C LDH HBDH LDL Diskusia K patogenéze COVID-19 Fáza vírusová zápalovej reakcie hostiteľa Štádium včasnej infekcie pulmonárne hyperinflamačné Ku vzťahu patogenézy a diagnostiky COVID-19 Štádium I ( vírusová fáza ) Klinika: horúčka, kašeľ, hnačka, bolesti hlavy Laboratórium: lymfopénia, zvýšené PT, D-dimer a LDH Štádium II ( vírusová fáza / fáza zápalovej reakcie hostiteľa ) Klinika: dyspnoe Laboratórium: hypoxia, patologický rtg nález na pľúcach, zvýšené transaminázy, znížený prokalcitonín Štádium III ( fáza zápalovej reakcie hostiteľa ) Klinika: ARDS, SARS, šok, kardiálna insuficiencia Laboratórim: zvýšené CRP, LDH, IL-6, D dimer, feritín, troponín, NT-proBNP K Reverse Real-Time PCR ( rRT PCR ): ide o kvantitatívne vyšetrenie kópií NK vírusu SARS-CoV-2 z nazofaryngeálneho a orofaryngeálneho steru (prípadne iných biologických materiálov) poznanie kompletného genómu SARS-CoV-2 umožnilo identifikáciu špecifických primérov a vytvorenie štandardných vyšetrovacích protokolov nakoľko sa jedná o RNK vírus, na amplifikáciu a získanie komplementárnej cDNA sa využíva enzým reverzná transkriptáza ( RT ) K cieľom ( targets ) ktoré možno detegovať metodikou ( rRT PCR ): RNA-dependentná RNA 96 polymeráza ( RdRp ) / helikáza ( Hel ) LoD: 11,2 RNA kópií pri senzitivite 95% vysoká špecificita (nebola dokázaná skrížená reaktivita) metodika implementová vo >30 laboratóriách v Európe RNA-dependentná RNA 96 polymeráza-Probe 2 ( RdRp-P2 ) LoD: 3,8 RNA kópií pri senzitivite 95% možná skrížená reaktivita s SARS-CoV Envelope ( E ) gén manuálne spracovanie - LoD: 5,2 RNA kópií pri senzitivite 95% Roche Cobas 6800 - LoD: 275,72 kópií pri 95% senzitivite jediný target plne automatizovanej metodiky Nukleokapsidový ( N ) gén LoD: 8,3 RNA kópií pri senzitivite 95% K interpretácii výsledkov pacienti s ťažkým priebehom majú až 60-násobne väčšiu vírusovú nálož ( viral load ), prítomnosť vírusovej RNA možno dokázať aj po 10 dňoch od začiatku príznakov vyšší viral load je asociovaný respiračným zlyhávaním, potrebou UPV, poruchou pečeňových funkcií a smrťou 90% pacientov s miernym priebehom dosiahne RT-PCR negativitu po 10 dňoch od začiatku príznakov negatívne výsledky nevylučujú infekciu interpretácia laboratórneho výsledku musí prebiehať súčasne s posudzovaním klinického obrazu K interpretácii výsledkov pomocnej laboratórnej diagnostiky Najčastejšie rutínne hematologické a biochemické patologické laboratórne nálezy Znížené hodnoty lymfocyty / lymfopénia ( 35-75% ) albumín / hypoalbuminémia ( 50-100% ) hemoglobín / anémia ( 40-50% ) Zvýšené hodnoty C-reaktívny proteín CRP ( 75-95 % ) laktát-dehydrogenáza LDH ( 30-90% ) rychlosť sedimentácie erytrocytov FW (85%) D-dimér ( 35-45 % ) Najvýznamnejšie prediktory ťažkého priebehu COVID-19 Znížené hodnoty lymfocyty / lymfopénia albumín/hypoalbuminémia Zvýšené hodnoty neutrofily/neutrofília laktát-dehydrogenáza LDH transaminázy AST, ALT troponín prokalcitonín C-reaktívny proteín CRP Porovnanie mortality MERS ( Middle East Respiratory Syndrom ) 35% SARS ( Severe Acute Respiratory Syndrom ) 10% COVID-19 ( Corona Virus Disease 19 ) 5% Distribúcia mortality < 10 rokov < 1% 10-20 rokov 1% 20-30 rokov 10% 30-80 rokov 90% > 80 rokov 5% K multidisciplinárnej spolupráci Je nevyhnutná spolupráca vedenia inštitúcie infektológie internej medicíny pneumológie intenzívnej starostlivosti pediatriae klinického laboratória K manažmentu pacienta Pri respiračnej symptomatológii alebo horúčke Vyšetrenie COVID-19 Pozitívne: izolácia na COVID-19 oddelení Negatívne: zopakovať vyšetrenie ( ak je výsledok negatívny zaradiť na normálne oddelenie ) Pri iných príznakoch ( v prípade prijatia ) COVID-19 vyšetrenie Pozitívny: izolácia na COVID-19 oddelení Negatívny: bežná starostlivosť K terapii v štádiu včasnej infekcie - podávať antivirotiká pulmonálnom - podávať antivirotiká + immunosupresíva hyperinflamačnom - podávať imunospresíva K liekom Antivirotiká lopinavir, hydroxychlorochín, remdesivir Imunosupresíva kortikosteroidy, IL inhibítory Nízkomolekulárny heparín v prípade koagulopatie Záver COVID-19 je ochorenie spôsobené vírusom SARS-CoV-2, ktorý sa prenáša kvapôčkami a postihuje pľúca Horúčka, kašeľ a únava sú hlavné klinické príznaky Inkubačná doba je do dvoch týždňov Riziko prenosu je hlavne v symptomatickej fáze, možnosť je aj v pre- a post-symptomatickej fáze Priebeh ochorenia v 80% prípadov mierny, v 20% ťažký až kritický Ohrození sú hlavne starší pacienti s komorbiditami Mortalita COVID-19 je v porovnaní s mortalitou SARS a MERS najnižšia Použitie metódy rRT PCR s využitím reverznej transkriptázy v rámci laboratórnej diagnostiky predstavuje metódou voľby Niektoré rutínne hematologické a biochemické parametre sú užitočné hlavne v kontexte predikcie ťažkého priebehu Výzvou je diferenciálna diagnostika COVID-19 voči chrípke a iným bežným respiračným infekciám Doporučenia Kvalitná vzorka je základný predpokladom spoľahlivého výsledku PCR predstavuje v súčasnosti metódou voľby Detekcia antigénu by predstavovala ideálny prístup na rýchlu diagnostiku, ale musela by mať podstatne vyššiu senzitivitu Vyšetrenie protilátok je komplementárne vyšetrenie za predpokladu senzitivity viac ako 70% a po uplynutí viac ako 5 dní od nástupu symptomatológie V kontexte vyššie uvedeného vidíme možnosti využitia rýchlotestov ( hlavne protilátok IgM, IgG ) v týchto prípadoch: pacienti na jednotkách intenzívnej terapie alebo hospitalizovaní po viac ako uplynutí 5 dní od nástupu symptomatológie pacienti s opakovane negatívnymi výsledkami vyšetrenia PCR ( za účelom potvrdenia infekcie, ak je podozrenie na falošnú negativitu PCR ) detekcia protilátok u zdravotníckeho personálu ( hlavne za účelom identifikácie už imunizovaných – prítomnosť IgG ) pochopenie epidemiologickej situácie ( postavenie / úloha asymptomatickej infekcie ) identifikácia vysoko reaktívnych donorov, ktorí vytvárajú hyperimúnne sérum za účelom terapeutického postupu ) klinické pokusy / plazma imunizovaných pacientov hodnotenie účinku vakcinácie ( do budúcna ) Literatúra Lippi G, Plebani M: Laboratory abnormalities in patients with COVID 2019 infection, Clin Chem Lab Med. 2020 Mar 3. doi: 10.155/cclm-2020-0198 ( E pub ) Center for Diseases Control and Prevention: Interim Guidelines for Collecting, Handling and testing Clinical Specimens from Patients for Coronavirus Disease 2019 Wu Z., Mc Gregor JM: Characteristics and Important Lessons From teh Coronavirus Disease 2019 ( COVID-19 ): Outbrake in China: Summary of a report of 72 314 Cases From the Chinese Center for Disease Control and Prevention: JAMA, 2020, Febr 24.doi:10.1001/jama.20202648 ( E pub ) Lippi G, Plebani M: The Novel Coronavirus ( 2019 nCoV ) outbreak: think the unthinkable and be prepared to face the challenge. Diagnosis ( Berl ).2020, Jan.28.doi:10.1515/dx-2020-0015. ( E pub ) WHO Coronavirus diseases 2019 ( COVID-19 ) Situation report-44 Mattiuzzi C, Lippi G: Which lessons shall we learn from the 2019 novel coronavirus outbreak ?, Ann Trans Med 2020, 8(3):48. Thang H et all: Angiotensin converting enzyme 2 ( ACE2 )as a SARS-CoV-2-receptor: molecular mechanisms and potential therpautic target: Intensive Care Med., 2020, Mar 3.doi: 10.1007/s00134-020-05985-9 ( E pub ) Kannan S, Shaik syed ali P, Sheeza A, Hemalatha K. COVID-19 (Novel Coronavirus 2019) - recent trends. Eur Rev Med Pharmacol Sci. 2020;24(4):2006-2011. Chan JF, Yip CC, To KK, et al. Improved molecular diagnosis of COVID-19 by the novel, highly sensitive and specific COVID-19-RdRp/Hel real-time reverse transcription-polymerase chain reaction assay validated and with clinical specimens. J Clin Microbiol. 2020; Tan SS, Yan B, Saw S, et al. Practical laboratory considerations amidst the COVID-19 outbreak: early experience from Singapore. J Clin Pathol. 2020; Pfefferle S, Reucher S, Nörz D, Lütgehetmann M. Evaluation of a quantitative RT-PCR assay for the detection of the emerging coronavirus SARS-CoV-2 using a high throughput system. Euro Surveill. 2020;25(9) Corman VM, Landt O, Kaiser M, et al. Detection of 2019 novel coronavirus (2019-nCoV) by real-time RT-PCR. Euro Surveill. 2020;25(3)

Web: Slovenská spoločnosť pre laboratórnu medicínu - SSLM | LAB-MED.sk
Aktualizované: 24.11.2023

prejsť na článok

Poznámky k patofyziologickému a klinickému kontextu COVID-19 so zameraním na laboratórnu diagnostiku

Odporúčania v súvislosti so šírením koronavírusu COVID-19

COVID-19 v Číne

Upozornenie pre pacientov podozrivých na Covid-19

Fyzioterapia v ambulancii

Stanovisko Slovenskej spoločnosti pre laboratórnu medicínu ( SSLM ) k problematike výkonov laboratór